Pseudotime Sexual Branch wild-type cells only

Gametocyte Development in Plasmodium berghei

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1. Introduction and Aims

We have merged the two datasets together in GCSKO_merge_wt.Rmd. We also subsetted out the pre-sexual-branch and the sexual cells (male and female) and stored them in a Seurat object called tenx.justwt.integrated.sex Here, we will perform pseudotime analysis on the dataset and build modules of genes that show similar expression across this pseudotime.

2. Read in the data

Load/Install the Required Packages

[1] "patchwork is loaded correctly"
[1] "viridis is loaded correctly"
[1] "Seurat is loaded correctly"
[1] "cowplot is loaded correctly"
[1] "gridExtra is loaded correctly"
[1] "grid is loaded correctly"
[1] "Hmisc is loaded correctly"
[1] "reshape2 is loaded correctly"
[1] "dplyr is loaded correctly"

Loading required package: circlize
========================================
circlize version 0.4.12
CRAN page: https://cran.r-project.org/package=circlize
Github page: https://github.com/jokergoo/circlize
Documentation: https://jokergoo.github.io/circlize_book/book/

If you use it in published research, please cite:
Gu, Z. circlize implements and enhances circular visualization
  in R. Bioinformatics 2014.

This message can be suppressed by:
  suppressPackageStartupMessages(library(circlize))
========================================

[1] "circlize is loaded correctly"
[1] "monocle3 is loaded correctly"

Loading required package: destiny

Attaching package: ‘destiny’

The following object is masked from ‘package:SummarizedExperiment’:

    distance

The following object is masked from ‘package:GenomicRanges’:

    distance

The following object is masked from ‘package:IRanges’:

    distance

[1] "destiny is loaded correctly"

load data

## load sex only branch cells saved from GCSKO_Sex_Branch_Analysis.Rmd
## Restore the objects
## load sex branch dataset
tenx.justwt.integrated.sex <- readRDS("../data_to_export/tenx.justwt.integrated.sex.RDS")
## load full dataset
#tenx.mutant.integrated <- readRDS("../data_to_export/tenx.mutant.integrated.RDS")

## add old pt values
## these values are calculated in hte GCSKO_pseudotime_allcells.Rmd script and so were added after the object was split into sex only.
#tenx.all <- readRDS("../data_to_export/tenx.mutant.integrated.RDS")
#tenx.all.meta <- as.data.frame(tenx.all@meta.data)
#tenx.all.meta <- tenx.all.meta[which(rownames(tenx.all.meta) %in% rownames(tenx.mutant.integrated.sex@meta.data)),]
#tenx.mutant.integrated.sex <- AddMetaData(tenx.mutant.integrated.sex, tenx.all.meta$old_pt_values, col.name = "old_pt_values")
## then remove these objects so they don't use up memory
#rm(tenx.all, tenx.all.meta)

Add a meta.data column so that 10X is listed as WT:

## get cells that are filtered out
mutant_cells <- which(tenx.justwt.integrated.sex$experiment == "mutants")

## make extra column in plotting df
tenx.justwt.integrated.sex@meta.data$identity_name_combined <- "WT_10X"
tenx.justwt.integrated.sex@meta.data$identity_name_combined[mutant_cells] <- tenx.justwt.integrated.sex@meta.data$identity_name_updated[mutant_cells]

## check
table(tenx.justwt.integrated.sex@meta.data$identity_name_combined)

wild-type    WT_10X 
      419      2398 

## create a list of our mutant gene IDs
list_of_mutant_genes <- c("PBANKA-0828000", "PBANKA-1302700", "PBANKA-1447900", "PBANKA-0102400", "PBANKA-0716500", "PBANKA-1435200", "PBANKA-1418100", "PBANKA-1144800", "PBANKA-0902300", "PBANKA-0413400", "PBANKA-1454800")

Read in gene annotations

gene_annotations <- read.table("../data/Reference/GenesByTaxon_Summary.csv", header = TRUE, sep = ",", stringsAsFactors = TRUE)
dim(gene_annotations)

[1] 5254    7

## convert _ to -
gene_annotations$Gene.ID <- gsub("_", "-", gene_annotations$Gene.ID)

3. Monocle on sex cells

calculate pseudotime and modules

Preparation

## extracts only 10x cells and also remove cluster 0 cells 
wt_cells <- rownames(tenx.justwt.integrated.sex@meta.data[which(tenx.justwt.integrated.sex@meta.data$identity_name_combined == "WT_10X" & !tenx.justwt.integrated.sex@meta.data$seurat_clusters == "3"),])

# & !tenx.justwt.integrated.sex@meta.data$seurat_clusters == "6"

## make a new Seurat of this
seurat.object <-subset(tenx.justwt.integrated.sex, cells = wt_cells)

## check that this is the same as the pb_sex_filtered object
#data_test <- as(as.matrix(GetAssayData(pb_sex_filtered, assay = "RNA", slot = "data")), 'sparseMatrix')
#is.equal
#is.identical

## extract counts and pheno:
## the reason we use the integrated and then subsetted is because these cells have been normalised whereas the cells in pb_sex_filtered have not been normalised (well they have but with doublets in them)
## with 10x only cells: all.equal(as.data.frame(counts(monocle.object)), as.data.frame(as.matrix(GetAssayData(seurat.object, assay = "RNA", slot = "counts")))) returns TRUE and also returns true when you change the slot input to "counts" and use monocle to norm it with method "log"
data <- as(as.matrix(GetAssayData(seurat.object, assay = "RNA", slot = "counts")), 'sparseMatrix')
## make phenodata
pd <- data.frame(seurat.object@meta.data)
## keep only the columns that are relevant in metadata
#pData <- pd %>% select(orig.ident, nCount_RNA, nFeature_RNA)
## make gene metadata
fData <- data.frame(gene_short_name = row.names(data), row.names = row.names(data))

## Construct monocle cds
monocle.object <- new_cell_data_set(expression_data = data, cell_metadata = pd, gene_metadata = fData)

## preprocess
monocle.object = preprocess_cds(monocle.object, num_dim = 50, norm_method = "log")
### if using integrated data:
# norm_method = "none", alignment_group = "~ experiment"

## plot jack straw plot
#plot_pc_variance_explained(monocle.object)

#monocle.object = reduce_dimension(monocle.object, reduction_method = "UMAP", preprocess_method = "PCA", umap.metric = "euclidean", umap.n_neighbors = 50, umap.min_dist = 0.5, verbose = FALSE)

#plot_cells(monocle.object, color_cells_by="experiment")

## graph learning

## add UMAP from Seurat
monocle.object@int_colData@listData$reducedDims@listData[["UMAP"]] <- seurat.object@reductions[["umap"]]@cell.embeddings
## if you want the old UMAP from the original all cells one, use: "DIM_UMAP"

## cluster
## this is essential to run the learn_graph function later on
monocle.object = cluster_cells(monocle.object)

## plot initial clustering by monocle
#plot_cells(monocle.object, color_cells_by="cluster", group_cells_by="partition", x = 2, y = 1)

## map pseudotime
monocle.object = learn_graph(monocle.object, learn_graph_control=list(ncenter=550, minimal_branch_len = 30), use_partition = FALSE)

  |                                                                                                                        
  |                                                                                                                  |   0%
  |                                                                                                                        
  |==================================================================================================================| 100%

# learn_graph_control=list(ncenter=500) - play with this parameter - lower tends to give fewer branches and higher tends to give more
# 500 - old analysis
# 250 - new analysis 

## Plot cells
plot_cells(monocle.object, color_cells_by="monocle_sex", group_cells_by="partition", x = 1, y = 2)

Redefine the identities of the male and female cells

male

# monocle.object_male <- choose_graph_segments(monocle.object)

female

# monocle.object_female <- choose_graph_segments(monocle.object)

bipotential

#monocle.object_bipot <- choose_graph_segments(monocle.object)

asexual

#monocle.object_asex <- choose_graph_segments(monocle.object)

asexual fate

#monocle.object_asex_fate <- choose_graph_segments(monocle.object)

check

# df_freq <- data.frame(table(c(colnames(monocle.object_male), colnames(monocle.object_female), colnames(monocle.object_bipot), colnames(monocle.object_asex), colnames(monocle.object_asex_fate))))
# paste("number of cells in seurat object is", length(colnames(monocle.object)), ". The number of cells selected here with an identitity is", dim(df_freq)[1])
# df_freq <- df_freq[df_freq$Freq > 1, ]
# df_freq

Inspect where these missing cells are:

# '%ni%' <- Negate('%in%')
# 
# not_assigned_cells <- colnames(monocle.object)[colnames(monocle.object) %ni% c(colnames(monocle.object_male), colnames(monocle.object_female), colnames(monocle.object_bipot), colnames(monocle.object_asex), colnames(monocle.object_asex_fate))]
# 
# DimPlot(seurat.object, repel = TRUE, label.size = 5, pt.size = 0.5, cells.highlight = not_assigned_cells, dims = c(2,1), reduction = "DIM_UMAP") +
#   coord_fixed() + 
#   scale_color_manual(values=c("#000000", "#f54e1e"))

# ## create annotation dataframe from these results:
# df_monocle_sexes <- rbind(data.frame("cell_name" = colnames(monocle.object_male), "sex" = rep("Male", length(colnames(monocle.object_male)))),
#                           data.frame("cell_name" = colnames(monocle.object_female), "sex" = rep("Female", length(colnames(monocle.object_female)))),
#                           data.frame("cell_name" = colnames(monocle.object_bipot), "sex" = rep("Bipotential", length(colnames(monocle.object_bipot)))),
#                           data.frame("cell_name" = colnames(monocle.object_asex), "sex" = rep("Asexual", length(colnames(monocle.object_asex)))),
#                           data.frame("cell_name" = colnames(monocle.object_asex_fate), "sex" = rep("Asexual_Fate", length(colnames(monocle.object_asex_fate)))),
#                           data.frame("cell_name" = not_assigned_cells, "sex" = rep("Unassigned", length(not_assigned_cells)))
#                           )
# 
# dim(df_monocle_sexes)
# 
# ## order like the metadata
# df_monocle_sexes <- df_monocle_sexes[match(rownames(monocle.object@colData), df_monocle_sexes$cell_name), ]
# 
# ## add this back into the monocle object
# monocle.object@colData$Sexes_monocle <- df_monocle_sexes$sex

Pseudotime Calculation

## Order the cells and calculate pseudotime
monocle.object = order_cells(monocle.object)

Listening on http://127.0.0.1:7749

## Plot
umap_pt <- plot_cells(monocle.object, color_cells_by = "pseudotime", label_cell_groups=FALSE, cell_size = 1, x = 1, y = 2, label_branch_points=FALSE, label_leaves=FALSE, label_groups_by_cluster=FALSE, label_roots = FALSE) +
  coord_fixed() +
  theme_void() +
  labs(title = "Pseudotime") +
  theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5, size=15), legend.position="bottom", legend.title=element_text (size=10), legend.text=element_text(size=10)) + 
  guides(colour = guide_colourbar(barwidth = 10, barheight = 0.5, title = "Pseudotime"))

## view
umap_pt

Check how well it correlates with the original pseudotime

when pseudotime was calculated on the whole object

library(ggpubr)
## extract pseudotime values:
pt_values_new <- as.data.frame(pseudotime(monocle.object, reduction_method = "UMAP"))
pt_values_new$cell_name <- rownames(pt_values_new)
meta_data_df <- as.data.frame(monocle.object@colData)
meta_data_df$cell_name <- rownames(meta_data_df)
meta_data_df <- merge(meta_data_df, pt_values_new, by = "cell_name")
names(meta_data_df)[ncol(meta_data_df)]<- "pt"

ggplot(meta_data_df, aes(x = old_pt_values, y = pt, colour = monocle_sex)) + 
  geom_point() +  
  geom_smooth(method = "lm", se = FALSE) +
  theme_classic() + stat_cor(method = "pearson")

Module Construction

## find genes that change as a function of pt:
monocle.object_pr_test_res <- graph_test(monocle.object, neighbor_graph="principal_graph", cores=8, expression_family = "negbinomial")

  |                                                                                                          |   0%, ETA NA
  |                                                                                                       |   0%, ETA 19:22
  |                                                                                                       |   0%, ETA 09:49
  |                                                                                                       |   0%, ETA 06:41
  |                                                                                                       |   0%, ETA 05:32
  |                                                                                                       |   0%, ETA 04:29
  |                                                                                                       |   0%, ETA 03:53
  |                                                                                                       |   0%, ETA 03:32
  |                                                                                                       |   0%, ETA 02:46
  |                                                                                                       |   0%, ETA 02:32
  |                                                                                                       |   0%, ETA 02:23
  |                                                                                                       |   0%, ETA 02:13
  |                                                                                                       |   0%, ETA 02:06
  |                                                                                                       |   0%, ETA 02:07
  |                                                                                                       |   0%, ETA 02:02
  |                                                                                                       |   0%, ETA 01:57
  |                                                                                                       |   0%, ETA 01:51
  |                                                                                                       |   0%, ETA 01:45
  |                                                                                                       |   0%, ETA 01:43
  |                                                                                                       |   0%, ETA 01:42
  |                                                                                                       |   0%, ETA 01:40
  |                                                                                                       |   0%, ETA 01:36
  |                                                                                                       |   0%, ETA 01:34
  |                                                                                                       |   0%, ETA 01:31
  |=                                                                                                      |   0%, ETA 01:29
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:26
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:24
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:24
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:23
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:21
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:19
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:17
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:16
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:15
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:14
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:14
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:13
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:10
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:11
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:10
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:09
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:08
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:07
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:08
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:08
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:07
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:05
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:04
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:04
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:03
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:03
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:02
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:01
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:01
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:01
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 01:00
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 00:59
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 00:59
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 00:58
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 00:57
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 00:58
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 00:57
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 00:57
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 00:55
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 00:55
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 00:55
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 00:55
  |=                                                                                                      |   1%, ETA 00:55
  |==                                                                                                     |   1%, ETA 00:54
  |==                                                                                                     |   1%, ETA 00:54
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:54
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:53
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:53
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:53
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:53
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:53
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:53
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:53
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:53
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:52
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:52
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:51
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:51
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:51
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:51
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:51
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:51
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:51
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:50
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:50
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:50
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:49
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:49
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:50
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:50
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:49
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:49
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:49
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:48
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:48
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:48
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:48
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:48
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:48
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:48
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:47
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:47
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:47
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:47
  |==                                                                                                     |   2%, ETA 00:47
  |===                                                                                                    |   2%, ETA 00:46
  |===                                                                                                    |   2%, ETA 00:46
  |===                                                                                                    |   2%, ETA 00:46
  |===                                                                                                    |   2%, ETA 00:46
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:46
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:46
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:46
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:45
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:45
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:45
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:45
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:45
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:45
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:45
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:45
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:44
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:44
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:44
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:44
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:44
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:44
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:44
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:44
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:44
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:42
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:42
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:42
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:42
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:43
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:42
  |===                                                                                                    |   3%, ETA 00:42
  |====                                                                                                   |   3%, ETA 00:42
  |====                                                                                                   |   3%, ETA 00:42
  |====                                                                                                   |   3%, ETA 00:42
  |====                                                                                                   |   3%, ETA 00:42
  |====                                                                                                   |   3%, ETA 00:42
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:42
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:41
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:41
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:41
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:41
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:41
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:41
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:41
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:41
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:41
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:41
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:40
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:40
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:40
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:40
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:40
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:40
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:40
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:40
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:40
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:39
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:39
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:40
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:40
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:40
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:40
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:40
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:39
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:39
  |====                                                                                                   |   4%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   4%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   4%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   4%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   4%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   4%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   4%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   4%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:39
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |=====                                                                                                  |   5%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   5%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   5%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   5%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   5%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   5%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   5%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   5%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   5%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |======                                                                                                 |   6%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   6%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   6%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   6%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   6%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   6%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   6%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   6%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   6%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   6%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   6%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:38
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |=======                                                                                                |   7%, ETA 00:39
  |========                                                                                               |   7%, ETA 00:39
  |========                                                                                               |   7%, ETA 00:39
  |========                                                                                               |   7%, ETA 00:39
  |========                                                                                               |   7%, ETA 00:39
  |========                                                                                               |   7%, ETA 00:39
  |========                                                                                               |   7%, ETA 00:39
  |========                                                                                               |   7%, ETA 00:39
  |========                                                                                               |   7%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   7%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   7%, ETA 00:39
  |========                                                                                               |   7%, ETA 00:39
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:39
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:39
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |========                                                                                               |   8%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   8%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   8%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   8%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   8%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   8%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   8%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   8%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   8%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   8%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   8%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   8%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   8%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:38
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:37
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:37
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:37
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:37
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:37
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:37
  |=========                                                                                              |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |   9%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |  10%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |  10%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |  10%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |  10%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |  10%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |  10%, ETA 00:38
  |==========                                                                                             |  10%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |  10%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |  10%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |  10%, ETA 00:37
  |==========                                                                                             |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  10%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |===========                                                                                            |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  11%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |============                                                                                           |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  12%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:37
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
  |=============                                                                                          |  13%, ETA 00:36
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  |=====================                                                                                  |  20%, ETA 00:32
  |=====================                                                                                  |  20%, ETA 00:32
  |=====================                                                                                  |  20%, ETA 00:31
  |=====================                                                                                  |  20%, ETA 00:31
  |=====================                                                                                  |  20%, ETA 00:31
  |=====================                                                                                  |  20%, ETA 00:31
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  |=====================                                                                                  |  20%, ETA 00:31
  |=====================                                                                                  |  20%, ETA 00:31
  |=====================                                                                                  |  20%, ETA 00:31
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  |=====================                                                                                  |  21%, ETA 00:31
  |=====================                                                                                  |  21%, ETA 00:31
  |=====================                                                                                  |  21%, ETA 00:31
  |=====================                                                                                  |  21%, ETA 00:31
  |=====================                                                                                  |  21%, ETA 00:31
  |=====================                                                                                  |  21%, ETA 00:31
  |=====================                                                                                  |  21%, ETA 00:31
  |=====================                                                                                  |  21%, ETA 00:31
  |=====================                                                                                  |  21%, ETA 00:31
  |=====================                                                                                  |  21%, ETA 00:31
  |======================                                                                                 |  21%, ETA 00:31
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  |======================                                                                                 |  21%, ETA 00:31
  |======================                                                                                 |  21%, ETA 00:31
  |======================                                                                                 |  21%, ETA 00:31
  |======================                                                                                 |  21%, ETA 00:31
  |======================                                                                                 |  21%, ETA 00:31
  |======================                                                                                 |  21%, ETA 00:31
  |======================                                                                                 |  21%, ETA 00:31
  |======================                                                                                 |  21%, ETA 00:31
  |======================                                                                                 |  21%, ETA 00:31
  |======================                                                                                 |  21%, ETA 00:31
  |======================                                                                                 |  21%, ETA 00:31
  |======================                                                                                 |  21%, ETA 00:31
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  |======================                                                                                 |  22%, ETA 00:31
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  |========================                                                                               |  23%, ETA 00:30
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  |========================                                                                               |  24%, ETA 00:30
  |========================                                                                               |  24%, ETA 00:30
  |========================                                                                               |  24%, ETA 00:30
  |========================                                                                               |  24%, ETA 00:30
  |========================                                                                               |  24%, ETA 00:30
  |========================                                                                               |  24%, ETA 00:30
  |========================                                                                               |  24%, ETA 00:30
  |========================                                                                               |  24%, ETA 00:30
  |========================                                                                               |  24%, ETA 00:30
  |========================                                                                               |  24%, ETA 00:30
  |========================                                                                               |  24%, ETA 00:30
  |========================                                                                               |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  24%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  25%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  25%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  25%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  25%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  25%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  25%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  25%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  25%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  25%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  25%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  25%, ETA 00:30
  |=========================                                                                              |  25%, ETA 00:30
  |==========================                                                                             |  25%, ETA 00:30
  |==========================                                                                             |  25%, ETA 00:30
  |==========================                                                                             |  25%, ETA 00:30
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  |==========================                                                                             |  25%, ETA 00:30
  |==========================                                                                             |  25%, ETA 00:30
  |==========================                                                                             |  25%, ETA 00:30
  |==========================                                                                             |  25%, ETA 00:30
  |==========================                                                                             |  25%, ETA 00:30
  |==========================                                                                             |  25%, ETA 00:30
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  |==========================                                                                             |  25%, ETA 00:29
  |==========================                                                                             |  25%, ETA 00:29
  |==========================                                                                             |  25%, ETA 00:29
  |==========================                                                                             |  25%, ETA 00:29
  |==========================                                                                             |  26%, ETA 00:29
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  |==========================                                                                             |  26%, ETA 00:29
  |==========================                                                                             |  26%, ETA 00:29
  |==========================                                                                             |  26%, ETA 00:29
  |==========================                                                                             |  26%, ETA 00:29
  |==========================                                                                             |  26%, ETA 00:29
  |==========================                                                                             |  26%, ETA 00:29
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  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
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  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
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  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
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  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  26%, ETA 00:29
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  |===========================                                                                            |  27%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  27%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  27%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  27%, ETA 00:29
  |===========================                                                                            |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
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  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
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  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
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  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
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  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:29
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  27%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  28%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  28%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  28%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  28%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  28%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  28%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  28%, ETA 00:28
  |============================                                                                           |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
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  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
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  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
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  |=============================                                                                          |  28%, ETA 00:28
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  |=============================                                                                          |  29%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  29%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  29%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  29%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  29%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  29%, ETA 00:28
  |=============================                                                                          |  29%, ETA 00:28
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  |====================================                                                                   |  35%, ETA 00:25
  |====================================                                                                   |  35%, ETA 00:25
  |====================================                                                                   |  35%, ETA 00:25
  |====================================                                                                   |  35%, ETA 00:25
  |====================================                                                                   |  35%, ETA 00:25
  |====================================                                                                   |  35%, ETA 00:25
  |====================================                                                                   |  35%, ETA 00:25
  |====================================                                                                   |  35%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  35%, ETA 00:25
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  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
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  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
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  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
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  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
  |=====================================                                                                  |  36%, ETA 00:25
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  |======================================                                                                 |  36%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  36%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  36%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
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  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
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  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
  |======================================                                                                 |  37%, ETA 00:25
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  |=======================================                                                                |  38%, ETA 00:25
  |=======================================                                                                |  38%, ETA 00:24
  |=======================================                                                                |  38%, ETA 00:24
  |=======================================                                                                |  38%, ETA 00:24
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  |=========================================                                                              |  39%, ETA 00:24
  |=========================================                                                              |  39%, ETA 00:24
  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
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  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
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  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
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  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
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  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
  |=========================================                                                              |  40%, ETA 00:24
  |==========================================                                                             |  40%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  40%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  40%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  40%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  40%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  40%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  40%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  40%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  40%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  40%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
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  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |==========================================                                                             |  41%, ETA 00:23
  |===========================================                                                            |  41%, ETA 00:23
  |===========================================                                                            |  41%, ETA 00:23
  |===========================================                                                            |  41%, ETA 00:23
  |===========================================                                                            |  41%, ETA 00:23
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  |===========================================                                                            |  42%, ETA 00:23
  |===========================================                                                            |  42%, ETA 00:23
  |===========================================                                                            |  42%, ETA 00:23
  |===========================================                                                            |  42%, ETA 00:23
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  |===========================================                                                            |  42%, ETA 00:23
  |===========================================                                                            |  42%, ETA 00:23
  |===========================================                                                            |  42%, ETA 00:23
  |===========================================                                                            |  42%, ETA 00:23
  |===========================================                                                            |  42%, ETA 00:23
  |===========================================                                                            |  42%, ETA 00:23
  |===========================================                                                            |  42%, ETA 00:23
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  |===========================================                                                            |  42%, ETA 00:23
  |===========================================                                                            |  42%, ETA 00:23
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  |===========================================                                                            |  42%, ETA 00:23
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  |============================================                                                           |  42%, ETA 00:23
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  |============================================                                                           |  42%, ETA 00:23
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  |============================================                                                           |  43%, ETA 00:23
  |============================================                                                           |  43%, ETA 00:23
  |============================================                                                           |  43%, ETA 00:23
  |============================================                                                           |  43%, ETA 00:22
  |============================================                                                           |  43%, ETA 00:22
  |============================================                                                           |  43%, ETA 00:22
  |============================================                                                           |  43%, ETA 00:22
  |============================================                                                           |  43%, ETA 00:22
  |============================================                                                           |  43%, ETA 00:22
  |============================================                                                           |  43%, ETA 00:22
  |============================================                                                           |  43%, ETA 00:22
  |============================================                                                           |  43%, ETA 00:22
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  |=============================================                                                          |  43%, ETA 00:22
  |=============================================                                                          |  43%, ETA 00:22
  |=============================================                                                          |  43%, ETA 00:22
  |=============================================                                                          |  43%, ETA 00:22
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  |=============================================                                                          |  43%, ETA 00:22
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  |=============================================                                                          |  44%, ETA 00:22
  |=============================================                                                          |  44%, ETA 00:22
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  |==============================================                                                         |  44%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  44%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  44%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  44%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  44%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  44%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  44%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  44%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  44%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
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  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:22
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:21
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:21
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:21
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:21
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:21
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:21
  |==============================================                                                         |  45%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  45%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  45%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  45%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  45%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  45%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  45%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  45%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  45%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  45%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  45%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  45%, ETA 00:21
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  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
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  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
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  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
  |===============================================                                                        |  46%, ETA 00:21
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  |================================================                                                       |  47%, ETA 00:21
  |================================================                                                       |  47%, ETA 00:21
  |================================================                                                       |  47%, ETA 00:21
  |================================================                                                       |  47%, ETA 00:21
  |================================================                                                       |  47%, ETA 00:21
  |================================================                                                       |  47%, ETA 00:21
  |================================================                                                       |  47%, ETA 00:21
  |================================================                                                       |  47%, ETA 00:21
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  |=================================================                                                      |  47%, ETA 00:21
  |=================================================                                                      |  47%, ETA 00:20
  |=================================================                                                      |  47%, ETA 00:20
  |=================================================                                                      |  47%, ETA 00:20
  |=================================================                                                      |  47%, ETA 00:20
  |=================================================                                                      |  47%, ETA 00:20
  |=================================================                                                      |  48%, ETA 00:20
  |=================================================                                                      |  48%, ETA 00:20
  |=================================================                                                      |  48%, ETA 00:20
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  |==================================================                                                     |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  49%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  50%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  50%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  50%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  50%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  50%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  50%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  50%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  50%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  50%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  50%, ETA 00:20
  |===================================================                                                    |  50%, ETA 00:20
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  |===================================================                                                    |  50%, ETA 00:20
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
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  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  50%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  51%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  51%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  51%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  51%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  51%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  51%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  51%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  51%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  51%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  51%, ETA 00:19
  |====================================================                                                   |  51%, ETA 00:19
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  |=======================================================================================================| 100%, ETA 00:00
  |=======================================================================================================| 100%, ETA 00:00
  |=======================================================================================================| 100%, ETA 00:00
  |===================================================================================================| 100%, Elapsed 00:41

# explains expression family - https://cole-trapnell-lab.github.io/monocle3/docs/differential/ - results were same for either defauly or negbinomial

## find significant genes
## I used 0.05 previously in all cells 
## 2884 w. p = 0.01, 3260 w. p = 0.05
pr_deg_ids <- row.names(subset(monocle.object_pr_test_res, q_value < 0.05))

## collect into modules
gene_module_df_sex <- find_gene_modules(monocle.object[pr_deg_ids,], resolution=c(10^seq(-6,2)), random_seed = 1234)

## how many genes in modules?
dim(gene_module_df_sex)

[1] 3528    5

[1] "there are 23 modules"

Plot Modules

General Module Composition

Make a dataframe to plot by aggregating clusters vs. modules

## make cell group df
cell_group_df <- tibble::tibble(cell=row.names(colData(monocle.object)), cell_group=colData(monocle.object)$seurat_clusters)

## make plotting df
#agg_mat <- aggregate_gene_expression(monocle.object, gene_module_df_sex, cell_group_df)

Find out how many genes there are per total so we can add this to the plot

## how many genes per module?
genes_per_module <- as.data.frame(table(gene_module_df_sex$module))
genes_per_module

Find out which modules our mutant genes reside in

## create a list of our mutant gene IDs
list_of_mutant_genes <- c("PBANKA-0828000", "PBANKA-1302700", "PBANKA-1447900", "PBANKA-0102400", "PBANKA-0716500", "PBANKA-1435200", "PBANKA-1418100", "PBANKA-0902300", "PBANKA-0413400", "PBANKA-1454800")

## make a dataframe to convert the gene IDs into actual IDs
ss2_mutants_final <- readRDS("../data_to_export/ss2_mutants_final.RDS")
df_mutant_ids <- as.data.frame(unique(cbind(ss2_mutants_final@meta.data$identity_gene_updated, ss2_mutants_final@meta.data$identity_updated, ss2_mutants_final@meta.data$identity_name_updated)))[-c(2),]
rm(ss2_mutants_final)
# remove the "820" bit on 10
df_mutant_ids$V1 <- gsub("_820", "", df_mutant_ids$V1)
# change the underscore (_) to a dash (-) in gene IDs
df_mutant_ids$V1 <- gsub("_", "-", df_mutant_ids$V1)
names(df_mutant_ids) <- c("gene_ID", "mutant_identity", "mutant_identity_2")

## subset modules df to include only mutant gene IDs
df_mutant_gene_modules <- as.data.frame(gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% list_of_mutant_genes),])
names(df_mutant_gene_modules)[1] <- "gene_ID"

## merge dataframes
df_mutant_gene_modules <- merge(df_mutant_gene_modules, df_mutant_ids, by = "gene_ID")

## Inspect
df_mutant_gene_modules[order(df_mutant_gene_modules$module), ]

so modules of interest are:

table(df_mutant_gene_modules$module)

 1  2  3  4  5  6  7  8  9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 
 0  0  3  0  0  0  0  2  0  0  0  0  4  0  0  0  0  0  0  0  1  0  0 

Which modules do other genes of interest lie in?:

## landmark genes (genes of interest)
# AP2G - PBANKA-1437500
# AP2 - PBANKA-0909600 - from poran paper
# AP2G-2 - PBANKA-1034300 
# ccp2 - "PBANKA-1319500" - female 820
# p25 - "PBANKA-0515000" - female
# p28 - "PBANKA-0514900" - female
# ccp3 - "PBANKA-1035200" - female -  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5909122/
# nek4 - "PBANKA-0616700" - female
# ap2-fg - "PBANKA-1415700" - female 
# dozi - "PBANKA-1217700" - female
# MG1 - "PBANKA-0416100" - male 820
# hap2 - "PBANKA-1212600" - male
# MAPK2 - "PBANKA-0933700" - male
# nek1 - "PBANKA-1443000" - male
# cdpk4 - "PBANKA-0615200" - male

## create a list of landmark genes
list_of_landmark_genes <- c("PBANKA-1437500",
                            "PBANKA-0909600",
                            "PBANKA-1034300", 
                            "PBANKA-1319500", 
                            "PBANKA-0515000",
                            "PBANKA-0514900",
                            "PBANKA-1035200",
                            "PBANKA-0616700",
                            "PBANKA-1415700",
                            "PBANKA-1217700",
                            "PBANKA-0416100", 
                            "PBANKA-1212600",
                            "PBANKA-0933700",
                            "PBANKA-1443000",
                            "PBANKA-0615200")

name_of_landmark_genes <- c("AP2-G", 
                            "AP2_poran", 
                            "AP2-G2", 
                            "ccp2", 
                            "p25", 
                            "p28",
                            "ccp3",
                            "nek4",
                            "ap2-fg",
                            "DOZI",
                            "mg1", 
                            "hap2", 
                            "mapk2",
                            "nek1",
                            "cdpk4")

## make a df
name_of_landmark_genes <- data.frame("gene_name" = name_of_landmark_genes, "id" = list_of_landmark_genes)

## make dataframe
df_landmark_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% list_of_landmark_genes),]

## merge dataframes
df_landmark_gene_modules <- merge(df_landmark_gene_modules, name_of_landmark_genes, by = "id")

## inspect
df_landmark_gene_modules[order(df_landmark_gene_modules$module), ]

enrichment of screen hits in modules

## read in screen hits
library("readxl")
screen_hits <- read_excel("../data/Screen/Modules_Clusters_Phenotypes.xlsx")

## get only hits
screen_hits_selected <- screen_hits[which(screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Both" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Females" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Males"), ] 

## extract gene IDs
gene_hits <- screen_hits_selected$`new gene ID`
## change the underscore to a dash
gene_hits <- gsub("_", "-", gene_hits)

## find out which modules they are in
df_hits_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% gene_hits),]
print("screen hits by module")

[1] "screen hits by module"

table(df_hits_gene_modules$module)

17  9 10  4  2  6 12 14  7 21  5 15 18 19 11 13 20 16 22 23  8  1  3 
 0  2  1  1  1  0  0  1  3  2  0  0  1  1  0  6  0  0  0  0  3  1  4 

## get the number genes screened in that module
screen_hits_screened <- screen_hits[which(screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Both" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Females" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "Males" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "None" | screen_hits$`Gam phenotype screen` == "male not enough power"), ] 
## extract gene IDs
genes_screened <- screen_hits_screened$`new gene ID`
## change the underscore to a dash
genes_screened <- gsub("_", "-", genes_screened)
## find out which modules they are in
df_screened_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% genes_screened),]
print("total genes screened in this module")

[1] "total genes screened in this module"

table(df_screened_gene_modules$module)

 17   9  10   4   2   6  12  14   7  21   5  15  18  19  11  13  20  16  22  23   8   1   3 
 11  23  24  31  45  34  16  25  32  17  73  49  32  20  41  43  22  20  19   9  47 111  57 

## make a table with this info
pc_screened <- data.frame(hits = table(df_hits_gene_modules$module), screened =  table(df_screened_gene_modules$module))[,-3]
names(pc_screened) <- c("module", "hits", "screened")
pc_screened$pc <- (pc_screened$hits /pc_screened$screened)*100

## view
pc_screened

Further investigation of screen hits

## rename df
df_screen_hits_selected <- as.data.frame(screen_hits_selected)
df_screen_hits_selected$'new gene ID' <- gsub("_", "-", df_screen_hits_selected$'new gene ID')
names(df_screen_hits_selected)[2] <- "id"
df_gene_module_df_sex <- as.data.frame(gene_module_df_sex)

## merge dfs together
screen_hits_modules <- merge(df_screen_hits_selected, df_gene_module_df_sex, by = "id")

## view
screen_hits_modules

ggsave("../images_to_export/screen_annotation.png", plot = screen_annotation, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 10, height = 10, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)

DOZI-regulated genes

Find out how many of the genes in each module has a DOZI-regulated gene

DOZI_regulated_genes <-
read.csv(file = "../data/Reference/DOZI_regulated_genes.csv", header = TRUE)

## extract gene IDs
dozi_genes <- DOZI_regulated_genes[DOZI_regulated_genes$DOZI_regulated. == "YES", ]$Gene_ID_PB
## change the underscore to a dash
dozi_genes <- gsub("_", "-", dozi_genes)

## find out which modules they are in
df_dozi_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% dozi_genes),]
print("dozi genes by module")

[1] "dozi genes by module"

table(df_dozi_gene_modules$module)

 1  2  3  4  5  6  7  8  9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 
 1 13  5  8 83  5  5  4  3  7 10 11  9  6 35  7  3 14  9  4  3  5  3 

get as a percentage

## make a table with the total number of genes in each module
test <- as.data.frame(table(gene_module_df_sex$module), stringsAsFactors=FALSE)
## reorder rows by module number
test <- test[order(as.numeric(test$Var1)),]
## combine the total number of dozi genes per module with the total number of genes per module
pc_screened <- data.frame(dozi = table(df_dozi_gene_modules$module), total =  test)[,-3]
names(pc_screened) <- c("module", "dozi_genes_per_module", "total_genes_per_module")
## calculate percentage
pc_screened$pc <- (pc_screened$dozi_genes_per_module /pc_screened$total_genes_per_module)*100

## view
pc_screened

ggsave("../images_to_export/dozi_annotation.png", plot = dozi_annotation, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 10, height = 10, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)

Essential genes

Find out how many of the genes in each module has a DOZI-regulated gene

## find out which modules all screened genes are in
df_screened_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% essential_genes$id),]
print("total genes screened in this module")

[1] "total genes screened in this module"

table(df_screened_gene_modules$module)

 17   9  10   4   2   6  12  14   7  21   5  15  18  19  11  13  20  16  22  23   8   1   3 
 60 102  95 115 149 110  79  63 106  42 109  74  55  52  83  81  47  64  32  23 112 179 133 

## extract 3 main phenotypes - there are only two fast genes, and 13 Insufficient data
e_genes <- essential_genes[essential_genes$phenotype == "Essential", ]$id
s_genes <- essential_genes[essential_genes$phenotype == "Slow", ]$id
d_genes <- essential_genes[essential_genes$phenotype == "Dispensable", ]$id

## find out which modules they are in
e_genes_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% e_genes),]
print("essential genes by module")

[1] "essential genes by module"

table(e_genes_gene_modules$module)

17  9 10  4  2  6 12 14  7 21  5 15 18 19 11 13 20 16 22 23  8  1  3 
40 67 56 62 84 62 52 30 53 16 17 16 17 22 32 27 20 33 10 10 47 49 62 

s_genes_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% s_genes),]
print("slow genes by module")

[1] "slow genes by module"

table(s_genes_gene_modules$module)

17  9 10  4  2  6 12 14  7 21  5 15 18 19 11 13 20 16 22 23  8  1  3 
 9 14 22 25 28 27 14 12 24 12 15  6  8  9 16 18  8 12  4  4 16 19 14 

d_genes_gene_modules <- gene_module_df_sex[which(gene_module_df_sex$id %in% d_genes),]
print("dispensible genes by module")

[1] "dispensible genes by module"

table(d_genes_gene_modules$module)

 17   9  10   4   2   6  12  14   7  21   5  15  18  19  11  13  20  16  22  23   8   1   3 
 10  20  17  27  37  20  13  21  28  13  76  52  30  21  35  36  19  18  18   9  49 110  55 

## change row order:
row.order <- c("10", "9", "17", "4", "2", "6", "12", "14",
               "21", "7", 
               "22", "23","13","16", "18", "19", "11", "15", "5",
               "20", "8", "3", "1"
               )
## change the module to a string
#pc_screened$module <- as.numeric(as.character(pc_screened$module))
#pc_screened$module <- as.factor(pc_screened$module)
#pc_screened <- pc_screened[match(row.order, pc_screened$module), ]
pc_screened$module <- factor(pc_screened$module, levels = rev(c("10", "9", "17", "4", "2", "6", "12", "14",
               "21", "7", 
               "22", "23","13","16", "18", "19", "11", "15", "5",
               "20", "8", "3", "1"
               )))

library(scales) # For the percent_format() function

 h1 <- ggplot(data = pc_screened, mapping = aes(x = module, fill=pc_e)) +
  geom_bar(col = "#FFFFFF", width = 1)+
      theme_void() +
    theme(panel.spacing.x = unit(1, "mm")) +
    scale_fill_continuous_sequential(palette = "Reds", labels = percent_format(scale = 1), limits=c(0,100)) +
  coord_flip()
 legend <- get_legend(h1)
 h1 <- h1 + theme(legend.position = "none")
 
  h2 <- ggplot(data = pc_screened, mapping = aes(x = module, fill=pc_s)) +
  geom_bar(col = "#FFFFFF", width = 1)+
      theme_void() +
    theme(panel.spacing.x = unit(1, "mm")) +
    scale_fill_continuous_sequential(palette = "Reds", labels = percent_format(scale = 1), limits=c(0,100)) +
  coord_flip()
 legend_2 <- get_legend(h2)
 h2 <- h2 + theme(legend.position = "none")
 
  h3 <- ggplot(data = pc_screened, mapping = aes(x = module, fill=pc_d)) +
  geom_bar(col = "#FFFFFF", width = 1)+
      theme_void() +
    theme(panel.spacing.x = unit(1, "mm")) +
    scale_fill_continuous_sequential(palette = "Reds", labels = percent_format(scale = 1), limits=c(0,100)) +
  coord_flip()
 legend_3 <- get_legend(h3 + theme(legend.position = "bottom", legend.box.margin = margin(0, 0, 0, 12)))
 h3 <- h3 + theme(legend.position = "none")
 
 ## add some space to the left of the legend as: https://wilkelab.org/cowplot/articles/shared_legends.html
#legend <- legend + theme(legend.box.margin = margin(0, 0, 0, 12))
 
 
bloodstage_annotation <- plot_grid(h1,h2,h3, nrow = 1, rel_widths = c(1,1,1))
bloodstage_annotation <- plot_grid(bloodstage_annotation,legend_3, nrow = 2, rel_heights = c(3,1))
bloodstage_annotation

ggsave("../images_to_export/bloodstage_annotation.png", plot = bloodstage_annotation, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 10, height = 10, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)

Visualise module expression

plot out modules

## make aggregated df again so you can edit it
agg_mat <- aggregate_gene_expression(monocle.object, gene_module_df_sex, cell_group_df)

## h clust the aggregated matrix
module_dendro <- hclust(dist(agg_mat))

## use these clusters to reorder the modules
gene_module_df_sex$module <- factor(gene_module_df_sex$module, levels = row.names(agg_mat)[module_dendro$order])

## plot
UMAP_modules <- plot_cells(monocle.object, genes=gene_module_df_sex %>% filter(module %in% c(1:length(levels(gene_module_df_sex$module)))),
           cell_size = 2, 
           x = 1, y = 2,
           label_cell_groups=FALSE,
           scale_to_range = TRUE,
           show_trajectory_graph=FALSE) +
                          scale_colour_viridis_c(name = "expression", option = "C", alpha = 1) +
                          coord_fixed() +
                          theme_void() +
                          theme(legend.position = "bottom", strip.text.x = element_text(size = 15))

Scale for 'colour' is already present. Adding another scale for 'colour', which will replace the existing scale.

## view
UMAP_modules

save

#ggsave("../images_to_export/GCSKO_sexbranch_umap_modules.png", plot = UMAP_modules, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 30, height = 30, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)

## make a dataframe of genes per module
genes_per_module <- as.data.frame(table(gene_module_df_sex$module))

## inspect
genes_per_module

## A. Preparation of dataframe

## prepare custom dataframe for all cells by modules:
agg_mat_no_group <- aggregate_gene_expression(monocle.object, gene_module_df_sex, scale_agg_values = TRUE)

## B. annotations

## make an anotation
## add pt to the monocle object
monocle.object@colData$pt_sex <- as.data.frame(pseudotime(monocle.object, reduction_method = "UMAP"))[,1]
## make an annotation dataframe
anno_no_group <- data.frame(monocle.object@colData$monocle_sex, monocle.object@colData$pt_sex, as.factor(monocle.object@colData$Prediction.Spearman._Kasia), row.names = rownames(monocle.object@colData))
names(anno_no_group) <- c("Sex", "Pseudotime", "Real_time_prediction")

## make annotation colours
annotation_colours <- list(Sex = c(Male="#016c00", Female="#a52b1e", Bipotential = "#ffe400", Asexual_Early = "#0052c5"),
                           Pseudotime = plasma(12, direction = 1),
                           Real_time_prediction = c("0" = viridis(8, direction = 1)[1] ,"1" =  viridis(8, direction = 1)[2] ,"4" = viridis(8, direction = 1)[3] ,"6" = viridis(8, direction = 1)[4] ,"8" = viridis(8, direction = 1)[5]  ,"12"  = viridis(8, direction = 1)[6]  ,"18" = viridis(8, direction = 1)[7]  ,"24" = viridis(8, direction = 1)[8]))

## change the order of the cols (cells) in data frame
col.order <- rownames(anno_no_group[with(anno_no_group, order(Sex, Pseudotime)), ])
agg_mat_no_group <- agg_mat_no_group[,col.order]

## reorder the rows (gene modules) in the data frame so they are in pt order
## define the order visually and using the clusters originally produced
row.order <- c("10", "9", "17", "4", "2", "6", "12", "14",
               "21", "7", 
               "22", "23","13","16", "18", "19", "11", "15", "5",
               "20", "8", "3", "1"
               )
## reorder using new order
agg_mat_no_group <- agg_mat_no_group[row.order, ]

## for cuts in columns - used later to count number of cells in each cat
df_meta <- as.data.frame(monocle.object@colData)
female_cells <- rownames(df_meta[which(df_meta$monocle_sex == "Female"), ])
male_cells <- rownames(df_meta[which(df_meta$monocle_sex == "Male"), ])
bi_cells <- rownames(df_meta[which(df_meta$monocle_sex == "Bipotential"), ])
asex_cells <- rownames(df_meta[which(df_meta$monocle_sex == "Asexual_Early"), ])
rm(df_meta)

## add module and the number of cells to the row
## change names for row names to include "module " at the begining of them
labels.row <- stringr::str_c("Module ", row.names(agg_mat_no_group))
## reorder frequency so that it is matching our matrix
genes_per_module_ordered <- genes_per_module[match(row.names(agg_mat_no_group), genes_per_module$Var1), ]
## add number of cells to the rownames for the module
for(i in seq_along(genes_per_module_ordered$Freq)){
  labels.row[i] <- stringr::str_c(labels.row[i]," (n = " ,genes_per_module_ordered$Freq[i], ")")
}

## C. Plotting

## plot
heatmap_main <- pheatmap::pheatmap(agg_mat_no_group,
                                   #scale="row",
                                   #color = diverging_hcl(100, palette = "Blue-Red 3"),
                                   cluster_cols = FALSE,
                                   cluster_rows = FALSE,
                                   ## others: ward.D2,
                                   #clustering_method="complete",
                                   scale = "none",
                                   show_colnames = FALSE,
                                   labels_row = labels.row,
                                   fontsize_row = 15,
                                   fontsize = 12,
                                   gaps_col = c(length(asex_cells), length(c(asex_cells,bi_cells)), length(c(asex_cells,bi_cells,female_cells))),
                                   annotation_col = anno_no_group, 
                                   annotation_colors = annotation_colours, 
                                   cutree_rows = 6
                                   )

## view
heatmap_main

save

ggsave("../images_to_export/GCSKO_sexbranch_heatmap.png", plot = heatmap_main, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 21, height = 21, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)

Visualise the expression of select genes over pseudotime

## landmark genes (genes of interest)
# AP2G - PBANKA-1437500
# AP2 - PBANKA-0909600 - from poran paper
# AP2G-2 - PBANKA-1034300 
#list_of_mutant_genes <- c("PBANKA-0828000", "PBANKA-1302700", "PBANKA-1447900", "PBANKA-0102400", "PBANKA-0716500", "PBANKA-1435200", "PBANKA-1418100", "PBANKA-1144800", "PBANKA-0902300", "PBANKA-0413400", "PBANKA-1454800")

## define genes to plot
list_of_genes_of_interest <- c("PBANKA-0102400", "PBANKA-0413400", "PBANKA-0716500", "PBANKA-0828000", "PBANKA-0902300", "PBANKA-1144800", "PBANKA-1302700", "PBANKA-1418100", "PBANKA-1435200", "PBANKA-1447900", "PBANKA-1454800", "PBANKA-1437500", "PBANKA-1319500", "PBANKA-0416100", "PBANKA-1034300")
## add names
names_of_genes_of_interest <- c("GCSKO-2", "GCSKO-10", "GCSKO-19", "GCSKO-3", "GCSKO-13", "GCSKO-28", "GCSKO-oom", "GCSKO-17", "GCSKO-20", "GCSKO-29", "GCSKO-21", "AP2-G", "CCP2", "MG1", "AP2-G2")

##make df for genes of interest
genes_of_interest <- data.frame(gene = list_of_genes_of_interest, group = c(1:length(list_of_genes_of_interest)), name = names_of_genes_of_interest)
## reorder
#genes_of_interest <- genes_of_interest[match(c("AP2-G", "CCP2", "GCSKO-21", "GCSKO-17", "GCSKO-2", "MG1", "GCSKO-20", "GCSKO-3", "GCSKO-oom", "GCSKO-29", "GCSKO-10", "GCSKO-28", "GCSKO-19", "GCSKO-13"), genes_of_interest$name), ]

## prepare custom dataframe for all cells by modules:
agg_mat_genes_of_interest <- aggregate_gene_expression(monocle.object, genes_of_interest[,1:2], scale_agg_values = FALSE)

## reorder using new order
agg_mat_genes_of_interest <- agg_mat_genes_of_interest[,col.order]

## plot
heatmap_plot <- pheatmap::pheatmap(agg_mat_genes_of_interest, 
                   #scale="row",
                   cluster_cols = FALSE,
                   cluster_rows = TRUE,
                   clustering_method="ward.D2",
                   show_colnames = FALSE,
                   labels_row = as.character(genes_of_interest[,3]),
                   gaps_col = c(length(asex_cells), length(c(asex_cells,bi_cells)), length(c(asex_cells,bi_cells,female_cells))),
                   #gaps_row = c(1, 6),
                   cutree_rows = 3,
                   ## trying to fix legend issue here
                   #fontsize_row = 10,
                   #fontsize_col = 3,
                   #cellheight=3, 
                   #cellwidth = 3,
                   legend = TRUE,
                   annotation_legend = FALSE,
                   annotation_col = anno_no_group, 
                   annotation_colors = annotation_colours
                   )

heatmap_plot

investigate specific modules

## rename df
df_screen_hits_selected_module <- as.data.frame(gene_module_df_sex[gene_module_df_sex$module == "20", ])

## merge dfs together
module_20_annotated <- merge(gene_annotations, df_screen_hits_selected_module,by.x = "Gene.ID", by.y = "id")

## view
View(module_20_annotated)

4. Mapping on mutants

pca plots

DimPlot(tenx.justwt.integrated.sex, reduction = 'pca', group.by = 'monocle_sex')

Seurat method

pancreas.anchors <- FindTransferAnchors(reference = seurat.object, query = SMARTSEQ, 
    dims = 1:30)
predictions <- TransferData(anchorset = pancreas.anchors, refdata = seurat.object$monocle_sex, 
    dims = 1:30)
pancreas.query <- AddMetaData(pancreas.query, metadata = predictions)

Final Figures

## C
## This shows the cells selected for module analysis 
## this package allows easy extraction of viridis values used in the pt plots
library("colourvalues") # allows 
## extract colour hex values 
monocle.object@colData$pt_sex_col <- colour_values(monocle.object@colData$pt_sex, palette = "plasma")

## load in the whole dataset if you haven't already loaded it in
#tenx.justwt.integrated <- readRDS("../data_to_export/tenx.justwt.integrated.RDS")

## extract metadata
df_plot <- tenx.justwt.integrated@meta.data

## add umap - merge on row names and then make sure row names are not dropped or added
df_plot <- transform(merge(df_plot, tenx.justwt.integrated@reductions[["umap"]]@cell.embeddings, by=0, all=TRUE), row.names=Row.names, Row.names=NULL)

## make new col for colours - and make everything grey
df_plot$hex <- "#e7e7e7"

## extract colours for highlighted cells 
df_plot_2 <- as.data.frame(monocle.object@colData[,"pt_sex_col", drop = FALSE])

## then merge this back into the colour column, whilst matching the rows
rownames_to_match <- rownames(df_plot[rownames(df_plot) %in% rownames(df_plot_2), ])

df_plot$hex[rownames(df_plot) %in% rownames(df_plot_2)] <- df_plot_2[match(rownames_to_match, rownames(df_plot_2)), , drop = FALSE][ ,1]

### make character so ggplto2 recognises them
df_plot$hex <- as.character(df_plot$hex)

## reorder so that the voloured points are on top
## this is a bit hacky but you can split the data frame and then remerge, since the command commented out will still put E above other values - this command was just order by the col hex
df_plot_1 <- df_plot[!(df_plot$hex == "#e7e7e7"), ]
df_plot_2 <- df_plot[(df_plot$hex == "#e7e7e7"), ]
df_plot <- rbind(df_plot_2, df_plot_1)
rm(df_plot_2, df_plot_1)

## add tree
##The tree for monocle is located here:
# monocle.object@principal_graph_aux[["UMAP"]]$dp_mst 
ica_space_df <- t(monocle.object@principal_graph_aux[["UMAP"]]$dp_mst) %>%
      as.data.frame() %>%
      dplyr::select_(prin_graph_dim_1 = "UMAP_1", prin_graph_dim_2 = "UMAP_2") %>%
      dplyr::mutate(sample_name = rownames(.),
                    sample_state = rownames(.))

dp_mst <- monocle.object@principal_graph[["UMAP"]]

edge_df <- dp_mst %>%
      igraph::as_data_frame() %>%
      dplyr::select_(source = "from", target = "to") %>%
      dplyr::left_join(ica_space_df %>%
                         dplyr::select_(
                           source="sample_name",
                           source_prin_graph_dim_1="prin_graph_dim_1",
                           source_prin_graph_dim_2="prin_graph_dim_2"),
                       by = "source") %>%
      dplyr::left_join(ica_space_df %>%
                         dplyr::select_(
                           target="sample_name",
                           target_prin_graph_dim_1="prin_graph_dim_1",
                           target_prin_graph_dim_2="prin_graph_dim_2"),
                       by = "target")


umap_zoom_plot <- ggplot(df_plot, aes(x = UMAP_1, y = UMAP_2, colour = hex)) +
                         geom_point(size = 2) +
                        ## need this to tell ggplot2 to map to values
                         scale_colour_identity() +
                        ## fix coordinates
                         coord_fixed() +
                         theme_void() + 
                         theme(legend.position = "none") +
                         geom_segment(aes_string(x="source_prin_graph_dim_1",
                                                 y="source_prin_graph_dim_2",
                                                 xend="target_prin_graph_dim_1",
                                                 yend="target_prin_graph_dim_2"
                                                 ),
                                      data=edge_df, inherit.aes = FALSE
                                      )
  
  
umap_zoom_plot

## remove big dataset
#rm(tenx.justwt.integrated)

# Extract the legend. Returns a gtable
leg <- get_legend(umap_pt)

# Convert to a ggplot and print
legend_d <- as_ggplot(leg)

legend_d

save

ggsave("../images_to_export/Figure_D.png", plot = umap_zoom_plot, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 21, height = 29.7, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)
ggsave("../images_to_export/Figure_D_legend.png", plot = legend_d, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 21, height = 29.7, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)

## C
## This shows the cells selected for module analysis 
## this package allows easy extraction of viridis values used in the pt plots
library("colourvalues") # allows 
## extract colour hex values 
monocle.object@colData$rt_sex_col <- colour_values(monocle.object@colData$Prediction.Spearman., palette = "viridis")

## load in the whole dataset if you haven't already loaded it in
#tenx.justwt.integrated <- readRDS("../data_to_export/tenx.justwt.integrated.RDS")

## extract metadata
df_plot <- tenx.justwt.integrated@meta.data

## add umap - merge on row names and then make sure row names are not dropped or added
df_plot <- transform(merge(df_plot, tenx.justwt.integrated@reductions[["umap"]]@cell.embeddings, by=0, all=TRUE), row.names=Row.names, Row.names=NULL)

## make new col for colours - and make everything grey
df_plot$hex <- "#e7e7e7"

## extract colours for highlighted cells 
df_plot_2 <- as.data.frame(monocle.object@colData[,"rt_sex_col", drop = FALSE])

## then merge this back into the colour column, whilst matching the rows
rownames_to_match <- rownames(df_plot[rownames(df_plot) %in% rownames(df_plot_2), ])

df_plot$hex[rownames(df_plot) %in% rownames(df_plot_2)] <- df_plot_2[match(rownames_to_match, rownames(df_plot_2)), , drop = FALSE][ ,1]

### make character so ggplto2 recognises them
df_plot$hex <- as.character(df_plot$hex)

## reorder so that the voloured points are on top
## this is a bit hacky but you can split the data frame and then remerge, since the command commented out will still put E above other values - this command was just order by the col hex
df_plot_1 <- df_plot[!(df_plot$hex == "#e7e7e7"), ]
df_plot_2 <- df_plot[(df_plot$hex == "#e7e7e7"), ]
df_plot <- rbind(df_plot_2, df_plot_1)
rm(df_plot_2, df_plot_1)

umap_zoom_plot_rt <- ggplot(df_plot, aes(x = UMAP_1, y = UMAP_2, colour = hex)) +
                         geom_point(size = 2) +
                        ## need this to tell ggplot2 to map to values
                         scale_colour_identity(guide = "legend") +
                        ## fix coordinates
                         coord_fixed()
  
# Extract the legend. Returns a gtable
leg <- get_legend(umap_zoom_plot_rt)

# Convert to a ggplot and print
legend_d <- as_ggplot(leg)

legend_d

  
umap_zoom_plot_rt+theme(legend.position = "none") +
                         theme_void()

## remove big dataset
#rm(tenx.justwt.integrated)

save

ggsave("../images_to_export/UMAP_sex_id.png", plot = umap_zoom_plot_rt, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 21, height = 29.7, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)

# 1 = blue - "#0052c5"
# 2 = red - "#a52b1e"
# 3 = green - "#016c00"
# 4 = yellow - "#ffe400"
#pal_sex <- c("#0052c5","#ffe400", "#a52b1e", "#016c00")

## extract pseudotime numbers and identity of cells to a dataframe
df_pt_id <- as.data.frame(monocle.object@colData[,c("pt_sex", "monocle_sex")])

## inspect possible values
list_of_sexes <- names(table(df_pt_id$monocle_sex))

## make a new column
df_pt_id$colour <- NA

## make colour ramps
asex_ramp <- colorRampPalette(c("#D5E3F5", "#0052c5"))
male_ramp <- colorRampPalette(c("#ABDDBF", "#016c00"))
female_ramp <- colorRampPalette(c("#F4C1BE", "#a52b1e"))
bipot_ramp <- colorRampPalette(c("white", "#ffe400"))

## re-classify the cells that are unassigned cells removed from sexual branch above:
#df_pt_id[which(rownames(df_pt_id) %in% remove_cells), ]$monocle_sex <- "Asexual"

## assign values to each cluster
## help here: https://stackoverflow.com/questions/9946630/colour-points-in-a-plot-differently-depending-on-a-vector-of-values 
df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Asexual_Early" | df_pt_id$monocle_sex == "Asexual_Late", ]$colour <- asex_ramp(100)[as.numeric(cut(df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Asexual_Early" | df_pt_id$monocle_sex == "Asexual_Late", ]$pt_sex,breaks = 100))]

df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Male", ]$colour <- male_ramp(100)[as.numeric(cut(df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Male", ]$pt_sex,breaks = 100))]

df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Female", ]$colour <- female_ramp(100)[as.numeric(cut(df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Female", ]$pt_sex,breaks = 100))]

df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Bipotential", ]$colour <- bipot_ramp(100)[as.numeric(cut(df_pt_id[df_pt_id$monocle_sex == "Bipotential", ]$pt_sex,breaks = 100))]

## ADD TO BIG OBJECT

## extract metadata
df_plot <- tenx.justwt.integrated@meta.data

## add umap - merge on row names and then make sure row names are not dropped or added
df_plot <- transform(merge(df_plot, tenx.justwt.integrated@reductions[["umap"]]@cell.embeddings, by=0, all=TRUE), row.names=Row.names, Row.names=NULL)

## make new col for colours - and make everything grey
df_plot$hex <- "#e7e7e7"

## extract colours for highlighted cells 
df_plot_2 <- as.data.frame(df_pt_id[,"colour", drop = FALSE])

## then merge this back into the colour column, whilst matching the rows
rownames_to_match <- rownames(df_plot[rownames(df_plot) %in% rownames(df_plot_2), ])

df_plot$hex[rownames(df_plot) %in% rownames(df_plot_2)] <- df_plot_2[match(rownames_to_match, rownames(df_plot_2)), , drop = FALSE][ ,1]

### make character so ggplto2 recognises them
df_plot$hex <- as.character(df_plot$hex)

## reorder so that the voloured points are on top
## this is a bit hacky but you can split the data frame and then remerge, since the command commented out will still put E above other values - this command was just order by the col hex
df_plot_1 <- df_plot[!(df_plot$hex == "#e7e7e7"), ]
df_plot_2 <- df_plot[(df_plot$hex == "#e7e7e7"), ]
df_plot <- rbind(df_plot_2, df_plot_1)
rm(df_plot_2, df_plot_1)

## make ggplot
umap_id_pt <- ggplot(df_plot, aes(x = UMAP_1, y = UMAP_2)) + 
                     geom_point(col = df_plot$hex) +
                     theme_void() +
                     coord_fixed()

umap_id_pt

save

ggsave("../images_to_export/UMAP_sex_id_pt.png", plot = umap_id_pt, device = "png", path = NULL, scale = 1, width = 21, height = 29.7, units = "cm", dpi = 300, limitsize = TRUE)

save modules

## modules are located in this object:
# gene_module_df_sex
write.csv(gene_module_df_sex, file = "../data_to_export/gene_module_df_sex.csv")

Appendix

Session Info

R version 4.0.3 (2020-10-10)
Platform: x86_64-apple-darwin17.0 (64-bit)
Running under: macOS Catalina 10.15.7

Matrix products: default
BLAS:   /System/Library/Frameworks/Accelerate.framework/Versions/A/Frameworks/vecLib.framework/Versions/A/libBLAS.dylib
LAPACK: /Library/Frameworks/R.framework/Versions/4.0/Resources/lib/libRlapack.dylib

locale:
[1] en_GB.UTF-8/en_GB.UTF-8/en_GB.UTF-8/C/en_GB.UTF-8/en_GB.UTF-8

attached base packages:
 [1] stats4    parallel  grid      stats     graphics  grDevices utils     datasets  methods   base     

other attached packages:
 [1] scales_1.1.1                scmap_1.10.0                latex2exp_0.4.0             colourvalues_0.3.7         
 [5] readxl_1.3.1                destiny_3.2.0               circlize_0.4.12             gganimate_1.0.7            
 [9] shiny_1.5.0                 monocle3_0.2.3.0            SingleCellExperiment_1.10.1 SummarizedExperiment_1.18.2
[13] DelayedArray_0.14.1         matrixStats_0.57.0          GenomicRanges_1.40.0        GenomeInfoDb_1.24.2        
[17] IRanges_2.22.2              S4Vectors_0.26.1            Biobase_2.48.0              BiocGenerics_0.34.0        
[21] Nebulosa_1.2.0              reshape2_1.4.4              Hmisc_4.4-1                 Formula_1.2-4              
[25] survival_3.2-7              lattice_0.20-41             gridExtra_2.3               dplyr_1.0.2                
[29] patchwork_1.0.1             ggplot2bdc_0.3.2            cowplot_1.1.0               ggpubr_0.4.0               
[33] ggplot2_3.3.2               viridis_0.5.1               viridisLite_0.3.0           Seurat_3.2.2               
[37] colorspace_1.4-1           

loaded via a namespace (and not attached):
  [1] ggthemes_4.2.4            coda_0.19-4               tidyr_1.1.2               knitr_1.30               
  [5] irlba_2.3.3               data.table_1.13.2         rpart_4.1-15              RCurl_1.98-1.2           
  [9] generics_0.0.2            callr_3.5.1               leidenbase_0.1.2          usethis_1.6.3            
 [13] RANN_2.6.1                proxy_0.4-24              future_1.19.1             spatstat.data_1.4-3      
 [17] httpuv_1.5.4              assertthat_0.2.1          gifski_0.8.6              xfun_0.18                
 [21] hms_0.5.3                 evaluate_0.14             promises_1.1.1            DEoptimR_1.0-8           
 [25] fansi_0.4.1               progress_1.2.2            DBI_1.1.0                 igraph_1.2.6             
 [29] htmlwidgets_1.5.2         spdep_1.1-5               purrr_0.3.4               ellipsis_0.3.1           
 [33] RSpectra_0.16-0           crosstalk_1.1.0.1         ks_1.12.0                 backports_1.1.10         
 [37] deldir_0.1-29             vctrs_0.3.4               TTR_0.24.2                remotes_2.2.0            
 [41] ROCR_1.0-11               abind_1.4-5               RcppEigen_0.3.3.7.0       withr_2.3.0              
 [45] grr_0.9.5                 robustbase_0.93-7         googleVis_0.6.10          checkmate_2.0.0          
 [49] vcd_1.4-8                 sctransform_0.3.1         xts_0.12.1                prettyunits_1.1.1        
 [53] mclust_5.4.7              goftest_1.2-2             cluster_2.1.0             lazyeval_0.2.2           
 [57] laeken_0.5.1              crayon_1.3.4              units_0.6-7               slam_0.1-47              
 [61] pkgconfig_2.0.3           labeling_0.4.2            tweenr_1.0.1              nlme_3.1-149             
 [65] pkgload_1.1.0             nnet_7.3-14               devtools_2.3.2            rlang_0.4.8              
 [69] globals_0.13.1            lifecycle_0.2.0           miniUI_0.1.1.1            rsvd_1.0.3               
 [73] randomForest_4.6-14       cellranger_1.1.0          rprojroot_1.3-2           polyclip_1.10-0          
 [77] RcppHNSW_0.3.0            lmtest_0.9-38             Matrix_1.2-18             raster_3.3-13            
 [81] carData_3.0-4             Matrix.utils_0.9.8        boot_1.3-25               zoo_1.8-8                
 [85] base64enc_0.1-3           ggridges_0.5.2            GlobalOptions_0.1.2       processx_3.4.4           
 [89] pheatmap_1.0.12           png_0.1-7                 bitops_1.0-6              KernSmooth_2.23-17       
 [93] DelayedMatrixStats_1.10.1 classInt_0.4-3            shape_1.4.5               stringr_1.4.0            
 [97] jpeg_0.1-8.1              rstatix_0.6.0             ggsignif_0.6.0            memoise_1.1.0            
[101] magrittr_2.0.1            plyr_1.8.6                hexbin_1.28.1             ica_1.0-2                
[105] gdata_2.18.0              zlibbioc_1.34.0           compiler_4.0.3            RColorBrewer_1.1-2       
[109] pcaMethods_1.80.0         fitdistrplus_1.1-1        cli_2.1.0                 LearnBayes_2.15.1        
[113] XVector_0.28.0            listenv_0.8.0             pbapply_1.4-3             ps_1.4.0                 
[117] htmlTable_2.1.0           ggplot.multistats_1.0.0   MASS_7.3-53               mgcv_1.8-33              
[121] tidyselect_1.1.0          stringi_1.5.3             forcats_0.5.0             yaml_2.2.1               
[125] latticeExtra_0.6-29       ggrepel_0.8.2             pbmcapply_1.5.0           tools_4.0.3              
[129] future.apply_1.6.0        rio_0.5.16                rstudioapi_0.11           foreign_0.8-80           
[133] smoother_1.1              scatterplot3d_0.3-41      farver_2.0.3              Rtsne_0.15               
[137] digest_0.6.27             BiocManager_1.30.10       Rcpp_1.0.6                car_3.0-10               
[141] broom_0.7.2               later_1.1.0.1             RcppAnnoy_0.0.16          httr_1.4.2               
[145] sf_0.9-6                  fs_1.5.0                  tensor_1.5                ranger_0.12.1            
[149] reticulate_1.18           splines_4.0.3             uwot_0.1.8                expm_0.999-5             
[153] spatstat.utils_1.17-0     sp_1.4-4                  spData_0.3.8              plotly_4.9.2.1           
[157] sessioninfo_1.1.1         xtable_1.8-4              jsonlite_1.7.1            spatstat_1.64-1          
[161] testthat_2.3.2            R6_2.5.0                  gmodels_2.18.1            pillar_1.4.6             
[165] htmltools_0.5.1.1         mime_0.9                  glue_1.4.2                fastmap_1.0.1            
[169] VIM_6.1.0                 class_7.3-17              codetools_0.2-16          utf8_1.1.4               
[173] pkgbuild_1.1.0            mvtnorm_1.1-1             tibble_3.0.4              curl_4.3                 
[177] leiden_0.3.3              gtools_3.8.2              zip_2.1.1                 openxlsx_4.2.2           
[181] limma_3.44.3              rmarkdown_2.5             desc_1.2.0                munsell_0.5.0            
[185] e1071_1.7-4               GenomeInfoDbData_1.2.3    haven_2.3.1               gtable_0.3.0             

Scaling values in the aggregated heatmap

getAnywhere(aggregate_gene_expression)

A single object matching ‘aggregate_gene_expression’ was found
It was found in the following places
  package:monocle3
  namespace:monocle3
with value

function (cds, gene_group_df = NULL, cell_group_df = NULL, norm_method = c("log", 
    "binary", "size_only"), pseudocount = 1, scale_agg_values = TRUE, 
    max_agg_value = 3, min_agg_value = -3, exclude.na = TRUE) 
{
    if (is.null(gene_group_df) && is.null(cell_group_df)) 
        stop("Error: one of either gene_group_df or cell_group_df must not be NULL")
    agg_mat <- normalized_counts(cds, norm_method = norm_method, 
        pseudocount = pseudocount)
    if (is.null(gene_group_df) == FALSE) {
        gene_group_df <- as.data.frame(gene_group_df)
        gene_group_df <- gene_group_df[gene_group_df[, 1] %in% 
            fData(cds)$gene_short_name | gene_group_df[, 1] %in% 
            row.names(fData(cds)), , drop = FALSE]
        short_name_mask <- gene_group_df[[1]] %in% fData(cds)$gene_short_name
        if (any(short_name_mask)) {
            geneids <- as.character(gene_group_df[[1]])
            geneids[short_name_mask] <- row.names(fData(cds))[match(geneids[short_name_mask], 
                fData(cds)$gene_short_name)]
            gene_group_df[[1]] <- geneids
        }
        agg_mat = as.matrix(my.aggregate.Matrix(agg_mat[gene_group_df[, 
            1], ], as.factor(gene_group_df[, 2]), fun = "sum"))
        if (scale_agg_values) {
            agg_mat <- t(scale(t(agg_mat)))
            agg_mat[agg_mat < min_agg_value] <- min_agg_value
            agg_mat[agg_mat > max_agg_value] <- max_agg_value
        }
    }
    if (is.null(cell_group_df) == FALSE) {
        cell_group_df <- as.data.frame(cell_group_df)
        cell_group_df <- cell_group_df[cell_group_df[, 1] %in% 
            row.names(pData(cds)), , drop = FALSE]
        agg_mat <- agg_mat[, cell_group_df[, 1]]
        agg_mat <- my.aggregate.Matrix(Matrix::t(agg_mat), as.factor(cell_group_df[, 
            2]), fun = "mean")
        agg_mat <- Matrix::t(agg_mat)
    }
    if (exclude.na) {
        agg_mat <- agg_mat[rownames(agg_mat) != "NA", colnames(agg_mat) != 
            "NA", drop = FALSE]
    }
    return(agg_mat)
}
<bytecode: 0x7ff952617628>
<environment: namespace:monocle3>

agg_mat = as.matrix(monocle3::my.aggregate.Matrix(agg_mat[gene_group_df[,1], ], as.factor(gene_group_df[, 2]), fun = "sum"))

Error in h(simpleError(msg, call)) : 
  error in evaluating the argument 'x' in selecting a method for function 'as.matrix': 'my.aggregate.Matrix' is not an exported object from 'namespace:monocle3'

## get an idea of the spread of z-score values 
# test <- (agg_mat_no_group)
# rowRanges(test)
# rowMeans(test)
# test <- t(agg_mat_no_group)
# names(test) = make.names(test)
# test = melt(test)
# ggplot(test, aes(x = Var2, y = value, group = Var2)) + geom_violin()
# rm(test)

In conclusion, the plots will look different if scaling is done by heatmap as it does not do the relimiting - i.e. anything < -3 and 3 < for the z-scores. the scaling is done on the transformed columns (e.g. when applying ‘scale’ to a matrix, it does it in a column-wise manner) which in this case, the modules are columns and so it does the correct scaling required. This is because the input is normalised cell counts and so the cells have already been scaled.